Dois anos depois, Peter Parker (Tobey Maguire) encara novos desafios enquanto tenta conciliar sua dupla identidade. Sua atração por Mary Jane (Kirsten Dunst) cresce ainda mais, tentando-o a revelar seu segredo à amada. A amizade com Harry (James Franco) se complica devido à amargura do jovem Osborn pela morte de seu pai e o crescente espírito de vingança contra o Homem-Aranha. Até mesmo Tia May (Rosemary Harris), que tem passado por momentos difíceis desde a morte do marido, começa a ter dúvidas em relação ao sobrinho. A vida de Peter está prestes a se tornar ainda mais complicada quando ele encontra um novo inimigo, o Dr. Octopus (Alfred Molina). Peter precisa ter todos os poderes à disposição para tentar acabar com este diabólico maníaco.