O filme conta a história de Peter Parker (Andrew Garfield), estudante rejeitado por seus colegas. Abandonado por seus pais quando criança, foi criado por seu tio Ben (Martin Sheen) e pela tia May (Sally Field). Como muitos adolescentes, Peter tenta descobrir quem ele é e como se tornou a pessoa que é hoje, ao mesmo tempo em que vive sua primeira paixão por Gwen Stacy (Stone). Tudo muda, porém, quando Peter descobre uma misteriosa maleta e começa uma jornada para entender o desaparecimento de seus pais – o que o leva à Oscorp e ao laboratório do Dr. Curt Connors (Rhys Ifans), antigo sócio de seu pai. Enquanto procura por respostas, o jovem comete um erro que o coloca em rota de colisão com o alter-ego do Dr. Connors, O Lagarto. Como Homem-Aranha, Peter tem de tomar decisões que podem alterar vidas, para usar seus poderes e moldar seu destino de se tornar um herói.